top of page

解析qPCR的重要指標|您的qPCR實驗數據可以使用嗎?

Updated: May 24

( Loading老半天,等 ~ 等等~ ~ 等等等~~~ 跑完了!!! …… 點開文件→ 打開數據→ 這data…能用嗎??? )

恭喜您取得了qPCR實驗數據,接下來讓我們一起認識qPCR的關鍵參數吧!go go ~


本文將探討qPCR數據的重要指標,協助您評估實驗結果的有效性


一、 擴增曲線


1.什麼是擴增曲線?

擴增曲線是指PCR過程中,以循環數為橫座標,以反應過程中即時螢光強度為縱座標所做的曲線。


2.優質的擴增曲線標準是什麼?

  • 擴增曲線有明顯的4個時期,擴增曲線整體平滑。

  • 基線平直或略微下降,無明顯的上揚趨勢。

  • 曲線指數擴增期上行角度清楚,無明顯下行趨勢。


 

二、 CT值


1.什麼是CT值?

CT值指擴增曲線穿過閾值的迴圈,表示每個PCR反應管內螢光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數


2.什麼是閾值?

一般將 PCR反應前15個循環的螢光信號作為螢光基底信號,螢光閾值是PCR前3 - 15個循環螢光信號標準差的10倍。 是另一個由軟體自動設置的參數,但也可手動調整。

 一般來說,每台儀器在使用前都已經設置好了螢光閾值,不需要改動



3.CT值能否使用的判斷標準?

  • 建議CT值範圍15 – 33之間。

  • 閾值在指數增長期,設置合理。

  • 實驗二重覆/三重覆之CT值SD<0.2。

  • 目標基因融解曲線單峰。 雜峰可能是非特異性擴增、氣溶膠、基因組污染導致,CT值表現為減小,可採取設置NTC(no template control)和NRT(no reverse transcriptase control)進行排除。

  • 擴增效率盡可能接近1,建議範圍90% - 110%。

 


三、 熔解曲線


1.什麼是熔解曲線?

熔解曲線分析在擴增階段完成後進行,指隨溫度升高DNA雙鏈解離,導致螢光強度下降的過程,用來判斷是否有非特異性擴增或引物二聚體(primer dimer)的產生。


2.什麼是Tm值?

Total DNA 雙鏈解離到一半時,大量產物解離造成螢光急遽下降,這時對應的溫度稱為熔解溫度(Tm),對熔解曲線求導(differentiation),就能得到一個特異峰。



3.熔解曲線能否使用的判斷標準?

熔解曲線單峰。 由於不同PCR產物熔解溫度不同,其Tm值也不同,以此可以對PCR的特異性進行鑒定,判斷是否存在非特異性擴增、氣溶膠、基因組污染。

 


相信大家在了解了這些關鍵參數後,能夠快速準確地分析數據的可用性。然而,在實際的數據分析過程中,我們經常遇到CT值偏高導致熔解曲線出現雜峰的情況,這直接影響了實驗數據的可用性。在這種情況下,使用一款靈敏度更高的定量試劑可以幫助我們改善這一問題。


MorreSYBR qPCR Master Mix(MORREBIO #MSYBR是一款專注於檢測低表達系統的通用型定量試劑,對於模板低、濃度低、表達量低的情況,能夠顯著改善CT值偏高的問題,其最低檢測限達到1.75 copies。全機型通用~靈敏度高~是您實驗的最佳好夥伴!!

3 views0 comments

Kommentare


bottom of page