( Loading老半天,等 ~ 等等~ ~ 等等等~~~ 跑完了!!! …… 點開文件→ 打開數據→ 這data…能用嗎？？？ )
恭喜您取得了qPCR實驗數據，接下來讓我們一起認識qPCR的關鍵參數吧！go go ~
本文將探討qPCR數據的重要指標，協助您評估實驗結果的有效性
一、 擴增曲線
１．什麼是擴增曲線?
擴增曲線是指PCR過程中，以循環數為橫座標，以反應過程中即時螢光強度為縱座標所做的曲線。
２．優質的擴增曲線標準是什麼？
擴增曲線有明顯的4個時期，擴增曲線整體平滑。
基線平直或略微下降，無明顯的上揚趨勢。
曲線指數擴增期上行角度清楚，無明顯下行趨勢。
二、 CT值
１．什麼是CT值?
CT值指擴增曲線穿過閾值的迴圈，表示每個PCR反應管內螢光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。
２．什麼是閾值?
一般將 PCR反應前15個循環的螢光信號作為螢光基底信號，螢光閾值是PCR前3 - 15個循環螢光信號標準差的10倍。 是另一個由軟體自動設置的參數，但也可手動調整。
一般來說，每台儀器在使用前都已經設置好了螢光閾值，不需要改動。
３．CT值能否使用的判斷標準?
建議CT值範圍15 – 33之間。
閾值在指數增長期，設置合理。
實驗二重覆/三重覆之CT值SD<0.2。
目標基因融解曲線單峰。 雜峰可能是非特異性擴增、氣溶膠、基因組污染導致，CT值表現為減小，可採取設置NTC（no template control）和NRT（no reverse transcriptase control）進行排除。
擴增效率盡可能接近1，建議範圍90% - 110%。
三、 熔解曲線
１．什麼是熔解曲線?
熔解曲線分析在擴增階段完成後進行，指隨溫度升高DNA雙鏈解離，導致螢光強度下降的過程，用來判斷是否有非特異性擴增或引物二聚體（primer dimer）的產生。
２．什麼是Tm值?
Total DNA 雙鏈解離到一半時，大量產物解離造成螢光急遽下降，這時對應的溫度稱為熔解溫度（Tm），對熔解曲線求導（differentiation），就能得到一個特異峰。
３．熔解曲線能否使用的判斷標準？
熔解曲線單峰。 由於不同PCR產物熔解溫度不同，其Tm值也不同，以此可以對PCR的特異性進行鑒定，判斷是否存在非特異性擴增、氣溶膠、基因組污染。
相信大家在了解了這些關鍵參數後，能夠快速準確地分析數據的可用性。然而，在實際的數據分析過程中，我們經常遇到CT值偏高導致熔解曲線出現雜峰的情況，這直接影響了實驗數據的可用性。在這種情況下，使用一款靈敏度更高的定量試劑可以幫助我們改善這一問題。
MorreSYBR qPCR Master Mix（MORREBIO #MSYBR）是一款專注於檢測低表達系統的通用型定量試劑，對於模板低、濃度低、表達量低的情況，能夠顯著改善CT值偏高的問題，其最低檢測限達到1.75 copies。全機型通用~靈敏度高~是您實驗的最佳好夥伴!!
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